大脑，作为生命活动的司令部，是结构和功能最为复杂的一种器官。因此，识别脑的三维结构，对于脑科学研究至关重要。然而由于技术的限制和脑结构的复杂性，多数脑形态结构图谱绘制工作局限于二维层面，高精度的小鼠脑三维参考图谱仍然进展缓慢。来自于ALLEN脑科学研究所的Lydia Ng团队历时三年，最终完成了迄今为止精度最高的小鼠脑三维图谱的构建——第三代小鼠脑框架(Mouse Brain Common Coordinate Framework,CCFv3)，相关工作于2020年4月发表在《cell》杂志。
脑图谱的绘制工作主要包括两个部分：(1)脑图像的采集；(2)对采集的脑图像进行区域划分和结构注释。目前标准的2D小鼠脑图谱是在采集小鼠脑切片图像的基础上来划分区域和注释结构的，例如艾伦参考图谱(ARA)和小鼠脑立体定位坐标(MBSC)。脑区的划分及注释可以基于细胞结构染色和髓鞘结构染色结果，同时也可以利用不同的基因表达、脑区间的连接模式与功能性质。不同模态的数据集都有可能揭示某些大脑区域的独特特征，多模态的结合将有望提高脑区域绘制的精度。然而，系统整合多模态的哺乳动物脑图谱尚未出现。
在此之前，来自美国西雅图的Allen脑科学研究所已经发布过了小鼠脑的3D参考图谱第一版和第二版(The Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework ,CCF)，但是仍然存在两个主要的问题：(1)在非冠状面将冠状面注释的2D结构转换为3D体积会引起图像失真;(2)目前大数据的工作需要更高精度的图谱。本次发布的研究CCFv3正好解决了上述局限。
How to integrate multimodalities data to construct a 3D altas
1，构建平均化空间模板
为了消除不同小鼠大脑之间的个体差异，CCFv3 是对 1675只成年小鼠脑使用双光子连续断层扫描成像 (STPT) 构建成的艾伦小鼠大脑连接图谱的整体均一化，其遵循了人体 MRI 为基础的群体均值模板的方法。简单来说，就是作者将每个小鼠大脑都拆分成若干voxel(立体像素),投射到空间坐标系中，然后将不同大脑的同一坐标上的voxel进行了迭代化处理，构建了具有10μm分辨率、各向同性(isotropic)的全脑空间图谱模板。
2，命名术语
在CCFv3中，结构的命名术语采用的是ARA脑图谱的结构本体论，当ARA结构本体论中未展示时，则参考来自MBSC和其它发表物的术语。
3，注释工作流和参考数据集
小鼠脑平均模板的注释是通过协调、迭代的工作流程来完成的。(1)作者通过回顾发表过的图谱和文献，对平均化空间模板和五种模态参考数据集进行可视化分析(转基因小鼠STPT成像的数据；Allen Mouse Connectivity Atlas的轴突投射数据；免疫组化；细胞结构染色；Allen Mouse Brain Atlas的原位杂交数据)。(2)神经解剖学家根据结构的大小和形状，按一定的间隔在冠状面、矢状面和横切面上描绘出每个结构。(3)以上交叠组织起来的结构由绘图和图像处理专家做填充、细化和平滑处理，再由神经解剖学家进行评估。(4)一旦达到一定数量的三维重建，个体和局部结构合并，此时小的重叠和间隙被固定，所有的voxel都被分配到一个单一的大脑结构中。
图1 小鼠脑图谱的注释工作流程
How the Alen mouse brain be parcellated by CCFv3
作者及其团队通过上述方法在CCFv3中对整个大脑做了细致的立体划分，将大脑皮质标记出43个区域，细分329个皮质下结构，以及8个脑室结构和81个纤维束。并且，他们在CCFv3中添加了新的结构区域，尽管这些脑区域早已在文献中报道，却尚未在其它图谱中被划分，例如：IPN 的亚区 IPRL；外侧膝状体(LGd)的背侧被进一步细分成 LGd-sh，LG-co，LG-ip 三个亚区；视辐射、听辐射、胼胝体的主体(ccb)、胼胝体上脑白质(scwm)4 个纤维束。
那么，在CCFv3中具体是如何来划分脑区的呢？下文将以划分isocortex的例子作为介绍。
第一步，研究者叠加平均模板和Cre转基因小鼠的STPT图像绘制整个isocortex的外边界。Calb1-Cre和 Fezf2-CreER小鼠可以区分isocortex的深、浅皮层(Calb 在浅皮层表达，Fezf 在深部皮层表达)；冠状面中，isocortex在前腹侧与梨状区分界；矢状面中，isocortex在前腹侧与梨状区分界，在后侧与postsubiculum和area prostriata分界；在横断面上，isocortex与嗅球的后方分界。
图2 绘制isocortex的边界
第二步，作者直接在这些2D视图上绘制边界，集成数据后通过沿着流线从表面外推，将表面2D视图转换为3D voxel。首先将isocortex分成初级视觉区、听觉区、躯体感觉区及后皮质区。随后通过转基因鼠标记将前面的四个分区进行细分(如将视觉区分成9个小分区)。作者从顶部视角重构了31个新皮层区，从侧视角重构了33个分区。从所有的表面观，小鼠新皮层总共被分为43个亚区。
此外，作者还通过组织学数据并运用5种转基因鼠(均在新皮层的每一层有特异性表达的基因)，将新皮层分为L1、L2/3、L4、L5、L6a和L6b层次。且这些脑新皮层的6层与43个皮层分区相交叉，形成了242个结构体积块。
How to use CCFv3
作者及其团队基于3D小鼠脑图谱的绘制开发了人机交互式操作访问图谱网站，http://atlas.brain-map.org。我们可以通过这个访问途径，选择以多种模式来查看脑图谱，例如2D展示、3D展示、体积估算等等。
图3 Allen Reference Atlase 的操作页面
Conclusion
脑的高级功能源于其数量巨大和类型复杂的神经细胞及其复杂的神经联接网络,高精度全脑神经联接图谱绘制是全面阐述神经系统功能、揭示大脑奥秘的必经之路。小鼠是研究脑科学的理想动物模型，CCFv3作为迄今为止精度最高的3D小鼠脑图谱，在三维空间上对脑区域进行了更加细致清晰地划分，展示了更多的解剖学细节，以及CCFv3是一种人机交互式访问操作的开放性资源，这些都给脑科学研究领域贡献了一把强有力的屠龙刀。
当然CCFv3作为持续更新不断发展的图谱，本项研究也有其局限所在，例如由于参考图谱比STPT成像的平均模板大15%左右，且平均模板和头骨基准点之间的关系未知，所以CCFv3暂不适用于立体定位坐标；手动划分区域和注释3D结构耗费的人力很大，作者希望引入人工智能技术，实现自动化的构建方式和更高的空间分辨率。但是局限就意味进步的空间，随着我们收集到的数据越来越多，在此基础上对大脑结构了解的越来越深，以及人工智能技术的发展，CCFv3的更新迭代势在必得，正如基因组序列的揭示于人类生命科学的贡献，脑图谱的工作也将为人类生命科学的探索点起另一盏明灯。
原文链接：DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.007